（一）6孔板接种和换液：

问：我的细胞传代很正常，但一种到六孔板里（不管加药和对照），总有两三个孔（随机）细胞长得不好，很小，像破碎了。有人遇到过这种情况吗？到底是啥原因呢？请各位指点

答：可能跟你加液的温度有关。如果你细胞刚刚拿出来换液加液，培养基也是从4度冰箱拿出来不久，很容易细胞就会冻死了。建议你最好把培养基先在培养箱里边孵育15min先。

另外，跟你细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。

或者放在37度水浴锅里孵育也可以，或者是培养板本身的问题，你再换换其他培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了，种板时的血清浓度调高试一下

问：最近几天，我用六孔培养板接种细胞，培养24小时后更换培养基，在更换培养基之前，显微镜观察到细胞贴壁，状态非常的好，更换了培养基后，立即用显微镜观察，发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小，产生大量的碎片，而另一半的细胞一切正常，异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭，上半个圆是好的，下半个圆就不好，这是怎么一回事？

答：你可以看一下是不是培养板没放水平。有一回我也出现过这种情况。

你的培养液如何，如果培养液过期，细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试。

我也经常碰到，我想可能是板的问题，换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。

不知楼主所需换液的培养板多不多，换培养基的时候如果没有注意风机的影响，特别是所需换液的培养板很多时，容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此，换液时应该逐个培养板进行，别怕浪费吸管，注意操作的效率！

（二）24孔板接种：

问：我把细胞消化接种到24孔板之后，已经四天了，老是每孔的中间部分长不满，每天换液时都用PBS 清洗，第二天换液时都出现同样的情况，每孔的边缘长的很好，中央大量死细胞，我也不知道是什么原因，请各位高手仁兄给把把脉，先谢过！！！！！！！！

答：是中央长不满，还是中央有和边缘相同密度的细胞，但是大部分都是死细胞？如果是前者，也许不是技术问题，而是物理问题了。

我是选择孔内铺盖玻片，在玻片上种植。每次换液都用PBS洗，必要的步骤吗？另外，也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关？

我想你的培养液可能加的太少了。由于表面张力的作用，培养板的边缘液体会向上走，造成培养液面呈现一个凹面（就像量筒的液体凹面一样），中央的细胞正好在凹面的最低处，培养液少，细胞的营养不够，甚至干涸掉，空气中的氧气也会造成损伤，即使有增值过来的细胞也会死掉。

估计你的培养液里可能有贵重的“银子”（因子）啊，想少用点吧，结果就…… ：）

另外，检查一下培养箱底部的水是否少了，如果少了，箱内的空气湿度不够，会造成培养液挥发加快，这样即使刚加的液体不少，过一段时间，由于蒸发，液体量会减少，造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度，造成渗透压过高。

个人经验认为这是物理问题:24孔板小，细胞接种进去后是很难摇均匀的，结果导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况.

至于中间较多死细胞，如果是悬浮状的话，也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞，似乎对摇均匀细胞有一定效果. 

在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意，不要把培养基吸得太干，如果完全吸取，很容易造成细胞干涸，这样的话细胞会很快死亡。我有一段时间总是遇到这个问题，一个板子中总有一两个孔出现细胞大量死亡，后来发现是上面的原因。现在我做的时候如果必须把液体吸干，我会一个一个空来吸取，最多一次不超过3孔，然后马上加入液体，同时在作转染时，我会在吸液和加液时将风机关掉，这样基本上会避免细胞死亡。

同时你所说的细胞周围密而中间稀疏，大约有如下原因：

1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。

2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。

我的细胞在接种在24孔板上时，孔的 周围细胞密集，中间细胞稀少，我试了很多次均如此。请问怎样操作才能使细胞分布均匀？

周围细胞密集，中间细胞稀少

这种情况一般是种板时培养液过少，液面总是呈一凹面，如果液面过低，孔中间就基本上没什么细胞，所以种板时一定不能吝啬培养液，待贴壁后可以用比较少量的培养液处理

周围细胞稀少，中间细胞密集:这种情况一般是种板后过于晃动，特别是旋转着晃动.有人才用十字方向的晃动方法使细胞分散均匀.但我个人认为，将细胞加入孔后，用枪或移液器充分吹打混匀后就不用，也不能再晃动，甚至拿着孔板走路带来的震动都会让细胞往中间集中.

当然，无论是哪种情况，首先都需要保证细胞在种板时时均匀分布的，即种板时的细胞悬液一定要混匀

细胞分布均匀与否有一点很关键，即每种细胞是有个体差异的，别人的细胞操作不一定适合于你.所以要靠自己摸索，且找出专属于自己细胞的一套规律，就我个人而言，有如下经验：

1.所有待接种的细胞悬液在种板前一定要用吸管混匀。

2.按资料记载，24孔板的液体量为1ml，个人也觉得1ml的量足矣。

3.接种时，要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头，这样做对细胞均匀分布有一定效果。

4.接种后最好直接放入培养箱让细胞适应培养板这个新的环境，个人认为没有必要在室温放置一段时间。

5.根据细胞的特性，细胞均喜欢聚集在边缘生长，所以我考虑到，你的问题还有可能是接种时的细胞密度不够，导致周边密集，中间稀疏的错觉。你的拌种密度是多少？

另"要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头"的意思就是:加样不能太快，避免细胞在一个加样处聚集，且注意在不同的部位进行加样，即边加边活动枪头，人为使细胞趋于均匀分布，我个人觉得有一定的效果，不知这次我解释清楚没有。